乙酰膽/堿酯酶（AchE）活性測(cè)定試劑盒說(shuō)明書(shū)

                                            微量法100T/96S

注   意 ：正式測(cè)定之前選擇2-3個(gè)預(yù)期差異大的樣本做預(yù)測(cè)定。

測(cè)定意義：

AchE屬于絲/氨酸水解酶，廣泛存在于各種動(dòng)物組織和血清中。AchE催化乙酰膽/堿（Ach）水解，在神經(jīng)傳導(dǎo)調(diào)節(jié)中起重要作用。

測(cè)定原理：

AchE催化Ach水解生成膽/堿，膽/堿與二硫?qū)ο趸郊姿幔?/span>DTNB）作用生成5-巰基-硝基苯甲酸（TNB）；TNB在412nm處有吸收峰，通過(guò)測(cè)定412 nm吸光度增加速率，計(jì)算AchE活性。

自備儀器和用品：

可見(jiàn)分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀、微量石英比色皿/96孔板、低溫離心機(jī)、水浴鍋、可調(diào)式移液槍和蒸餾水。

試劑組成和配制：

試劑一：液體×1瓶，4℃保存。

試劑二：液體×1瓶，4℃保存。

試劑三：粉劑×1支，4℃保存。臨用前加入1.3 mL試劑二，充分震蕩溶解。

試劑四：粉劑×1支，4℃保存。臨用前加入1.3 mL試劑二，充分震蕩溶解。

粗酶液提取：

1.        組織：按照組織質(zhì)量（g）：試劑一體積(mL)為1：5~10的比例（建議稱(chēng)取約0.1g組織，加入1mL試劑一）進(jìn)行冰浴勻漿，8000g 4℃離心10min，取上清液待測(cè)。

2.        細(xì)菌、真菌：按照細(xì)胞數(shù)量（10⁴個(gè)）：試劑一體積（mL）為500~1000：1的比例（建議500萬(wàn)細(xì)胞加入1mL試劑一），冰浴超聲波破碎細(xì)胞（功率300w，超聲3秒，間隔7秒，總時(shí)間3min）；然后8000g，4℃，離心10min，取上清置于冰上待測(cè)。

3.        血清等液體：直接測(cè)定。

測(cè)定操作：

1.        分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀預(yù)熱30 min，調(diào)節(jié)波長(zhǎng)到412 nm，蒸餾水調(diào)零。

2. 試劑二置于37℃水浴中預(yù)熱30min。

3. 取微量石英比色皿/96孔板，依次加入20μL上清液、160 μL試劑二、10μL試劑三和10μL試劑四，迅速混勻，于412nm處測(cè)定3min內(nèi)吸光值變化，第10s吸光值記為A1，第190s吸光值記為A2。△A測(cè)定管=A2-A1。

AchE活性計(jì)算：

a.使用微量石英比色皿測(cè)定的計(jì)算公式如下

1.        組織AchE活性

（1）按照蛋白濃度計(jì)算

活性單位定義：每毫克蛋白每分鐘催化產(chǎn)生1nmol TNB的酶量為1個(gè)酶活單位。

AchE酶活(nmol/min/mg prot)= (△A÷ε÷d×V反總×10⁹)÷（Cpr ×V樣）÷T

= 245×△A÷Cpr

（2）按照樣本質(zhì)量計(jì)算

活性單位定義：每克組織每分鐘催化產(chǎn)生1nmol TNB的酶量為1個(gè)酶活單位。

AchE酶活(nmol/min/g 鮮重)= (△A÷ε÷d×V反總×10⁹)÷（W ×V樣÷V樣總）÷T

= 245×△A÷W

2.        細(xì)菌、細(xì)胞AchE活性

活性單位定義：每10⁴個(gè)細(xì)胞每分鐘催化產(chǎn)生1nmol TNB的酶量為1個(gè)酶活單位。

AchE酶活(nmol/min/10⁴ cell)= (△A÷ε÷d×V反總×10⁹)÷（細(xì)胞數(shù)量×V樣÷V樣總）÷T

= 245×△A÷細(xì)胞數(shù)量

3.        血清AchE活性

活性單位定義：每毫升血清每分鐘催化產(chǎn)生1nmol TNB的酶量為1個(gè)酶活單位。

AchE酶活(nmol/min /mL)= (△A÷ε÷d×V反總×10⁹)÷V樣÷T

=245×△A

ε：TNB摩爾消光系數(shù)，13.6×10³ L/mol/cm；d：比色皿光徑，1 cm；V反總：反應(yīng)體系總體積（L），200μL=2×10^-4L；V樣總：提取液體積，1 mL；10⁶：1mol=1×10⁶μmol；Cpr：蛋白濃度（mg/mL）；V樣：加入上清液體積（mL），0.02 mL；W ：樣品質(zhì)量；T：反應(yīng)時(shí)間（min），3 min。

b.使用96孔板測(cè)定的計(jì)算公式如下

1.        組織AchE活性

（1）按照蛋白濃度計(jì)算

活性單位定義：每毫克蛋白每分鐘催化產(chǎn)生1nmol TNB的酶量為1個(gè)酶活單位。

AchE酶活(nmol/min/mg prot)= (△A÷ε÷d×V反總×10⁹)÷（Cpr ×V樣）÷T

= 490×△A÷Cpr

（2）按照樣本質(zhì)量計(jì)算

活性單位定義：每克組織每分鐘催化產(chǎn)生1nmol TNB的酶量為1個(gè)酶活單位。

AchE酶活(nmol/min/g 鮮重)= (△A÷ε÷d×V反總×10⁹)÷（W ×V樣÷V樣總）÷T

= 490×△A÷W

2.        細(xì)菌、細(xì)胞AchE活性

活性單位定義：每10⁴個(gè)細(xì)胞每分鐘催化產(chǎn)生1nmol TNB的酶量為1個(gè)酶活單位。

AchE酶活(nmol/min/10⁴ cell)= (△A÷ε÷d×V反總×10⁹)÷（細(xì)胞數(shù)量×V樣÷V樣總）÷T

= 490×△A÷細(xì)胞數(shù)量

3.        血清AchE活性

活性單位定義：每毫升血清每分鐘催化產(chǎn)生1nmol TNB的酶量為1個(gè)酶活單位。

AchE酶活(nmol/min /mL)= (△A÷ε÷d×V反總×10⁹)÷V樣÷T

=490×△A

ε：TNB摩爾消光系數(shù)，13.6×10³ L/mol/cm；d：96孔板光徑，0.5 cm；V反總：反應(yīng)體系總體積（L），200μL=2×10^-4L；V樣總：提取液體積，1 mL；10⁶：1mol=1×10⁶μmol；Cpr：蛋白濃度（mg/mL）；V樣：加入上清液體積（mL），0.02 mL；W ：樣品質(zhì)量；T：反應(yīng)時(shí)間（min），3 min。

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