H₂S含量測定試劑盒說明書

                                         微量法100T/96S

注    意：正式測定之前選擇2-3個預(yù)期差異大的樣本做預(yù)測定。

測定意義：

H₂S是一種新型氣態(tài)信號分子，存在于腦內(nèi)的神經(jīng)遞質(zhì)，生理濃度的H₂S對神經(jīng)系統(tǒng)海馬的長時程增強(qiáng)功能具有重要的調(diào)節(jié)作用，并對自發(fā)性高血壓、出血性休克及肝硬化等疾病的過程發(fā)揮著重要的病理生理效應(yīng)。

測定原理：

H₂S與醋酸鋅、N, N-二甲基對苯二胺和硫酸鐵銨等反應(yīng)生成亞甲基藍(lán)，亞甲基藍(lán)在665nm處有最大吸收峰，通過測定其吸光值可計算H₂S含量。

自備實驗用品及儀器：

天平、低溫離心機(jī)、酶標(biāo)儀、96孔板、蒸餾水。

試劑組成和配制：

提取液：液體100mL×1瓶，4℃保存。

試劑一：液體25mL×1瓶，4℃保存。

試劑二：液體16mL×1瓶，4℃保存。

試劑三：液體8mL×1瓶，4℃避光保存。

試劑四：液體8mL×1瓶，4℃保存。

試劑五：液體1.5mL×1管，4℃避光保存。

樣品處理：

1.        組織：按照組織質(zhì)量（g）：提取液體積(mL)為1：5~10的比例（建議稱取約0.1g組織，加入1mL提取液）進(jìn)行冰浴勻漿，然后10000g，4℃離心10min，取上清，置冰上待測。

2.        細(xì)菌、真菌：按照細(xì)胞數(shù)量（10⁴個）：提取液體積（mL）為500~1000：1的比例（建議500萬細(xì)胞加入1mL提取液），冰浴超聲波破碎細(xì)胞（功率300w，超聲3秒，間隔7秒，總時間3min）；然后10000g，4℃，離心10min，取上清置于冰上待測。

3.        血清（漿）：直接測定。

操作表：

1、   酶標(biāo)儀預(yù)熱30min，調(diào)節(jié)波長至665nm。

2、   操作表

H₂S含量計算公式：

用96孔板測定的計算公式如下

標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為：y = 0.0022x，R² = 0.9988

（1）組織樣品

a.按照蛋白濃度計算

H₂S（nmol/mg prot）=×V反總÷(V樣×Cpr)=681.8×ΔA÷Cpr

b.按照樣本重量計算

H₂S（nmol/g 鮮重）=×V反總÷(V樣÷V樣總×W)= 681.8×ΔA÷W

(3) 細(xì)胞

H₂S（nmol/10⁴ cell）=×V反總÷（V樣÷V樣總×細(xì)胞數(shù)量(萬個)）=681.8×ΔA÷細(xì)胞數(shù)量（萬個）

（2）液體樣品H₂S（nmol/mL）=×V反總÷V樣= 681.8×ΔA

V反總：反應(yīng)總體積，0.225mL；V樣：反應(yīng)中樣品體積，0.15mL；V樣總：加入提取液體積，1mL；W：樣品質(zhì)量，g；Cpr：蛋白濃度，mg/mL

注意事項：

Z低檢出限為1nmol/mL。