抗壞血酸氧化酶（ascorbate oxidase，AAO）活性測定試劑盒說明書

                                                    微量法100T/96S

注    意：正式測定之前選擇2-3個(gè)預(yù)期差異大的樣本做預(yù)測定。

測定意義：

AAO是定位于植物細(xì)胞壁的糖蛋白，屬“藍(lán)銅氧化酶"家族。細(xì)胞壁內(nèi)的抗壞血酸和AAO與細(xì)胞壁的代謝和生長有著密切的聯(lián)系。AAO 氧化 AsA 所形成的 MDHA 可通過質(zhì)膜上的細(xì)胞色素b還原，該過程中電子的跨膜運(yùn)輸能夠促進(jìn)細(xì)胞生長。

測定原理：

AAO可直接氧化AsA，通過測定AsA的氧化量，可計(jì)算得AAO活力。

實(shí)驗(yàn)中所需儀器及設(shè)備：

低溫離心機(jī)、紫外分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀、微量石英比色皿/96孔板（UV板）、可調(diào)式移液器、研缽、冰、蒸餾水。

試劑組成和配制：

試劑一：液體100mL×1瓶，4℃保存。

試劑二：液體20mL×1瓶，4℃保存。

試劑三：粉劑×1瓶，4℃保存。臨用前加入2mL蒸餾水充分溶解。

粗酶液提取：

按照組織質(zhì)量（g）：試劑一體積(mL)為1：5~10的比例（建議稱取約0.1g組織，加入1mL試劑一）進(jìn)行冰浴勻漿。16000g，4℃離心10min，取上清置冰上待測。

AAO測定操作：

1. 分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀預(yù)熱30 min，調(diào)節(jié)波長到265 nm。

2. 試劑二在25℃水浴鍋中預(yù)熱30 min。

3. 依次在微量石英比色皿/96孔板中加入20μL上清液、170μL預(yù)熱的試劑二和10μL試劑三，迅速混勻后在265nm測定10s和130s光吸收A1和A2，△A =A1-A2。

AAO活性計(jì)算公式：

a.使用微量石英比色皿測定的計(jì)算公式如下

(1). 按蛋白濃度計(jì)算

AAO活性單位定義：25℃中每毫克蛋白每分鐘氧化1nmol AsA 為1個(gè)酶活單位。

AAO(nmol/min /mg prot) = △A÷(ε×d）×V反總×10⁹÷(Cpr×V樣)÷T

= 92.4×△A÷Cpr

(2). 按樣本質(zhì)量計(jì)算

AAO活性單位定義：25℃中每克樣本每分鐘氧化1nmol AsA 為1個(gè)酶活單位。

AAO(nmol/min/g 鮮重) = △A÷(ε×d）×V反總×10⁹÷(W×V樣÷V樣總)÷T

= 92.4×△A÷W

ε：AsA在265nm處摩爾吸光系數(shù)為5.42×10⁴ L/mol/cm；d：比色皿光徑（cm），1 cm； V反總：反應(yīng)體系總體積（L），200μL=2×10^-4 L；10⁶：1mol=1×10⁶μmol；Cpr：上清液蛋白質(zhì)濃度（mg/mL），需要另外測定，建議使用本公司BCA蛋白質(zhì)含量測定試劑盒；W ：樣品質(zhì)量；V樣：加入反應(yīng)體系中上清液體積（mL），20μL=0.02 mL；V樣總：提取液體積，1 mL；

T：催化反應(yīng)時(shí)間（min），2min。

b.使用96孔板測定的計(jì)算公式如下

(1). 按蛋白濃度計(jì)算

AAO活性單位定義：25℃中每毫克蛋白每分鐘氧化1nmol AsA 為1個(gè)酶活單位。

AAO(nmol/min /mg prot) = △A÷(ε×d）×V反總×10⁹÷(Cpr×V樣)÷T

=184.8×△A÷Cpr

(2). 按樣本質(zhì)量計(jì)算

AAO活性單位定義：25℃中每克樣本每分鐘氧化1nmol AsA 為1個(gè)酶活單位。

AAO(nmol/min/g 鮮重) = △A÷(ε×d）×V反總×10⁹÷(W×V樣÷V樣總)÷T

= 184.8×△A÷W

ε：AsA在265nm處摩爾吸光系數(shù)為5.42×10⁴ L/mol/cm；d：96孔板光徑（cm），0.5 cm； V反總：反應(yīng)體系總體積（L），200μL=2×10^-4 L；10⁶：1mol=1×10⁶μmol；Cpr：上清液蛋白質(zhì)濃度（mg/mL），需要另外測定，建議使用本公司BCA蛋白質(zhì)含量測定試劑盒；W ：樣品質(zhì)量；V樣：加入反應(yīng)體系中上清液體積（mL），20μL=0.02 mL；V樣總：提取液體積，1 mL；

T：催化反應(yīng)時(shí)間（min），2min。

注意事項(xiàng):

配制好的試劑放在4℃保存，三天內(nèi)使用完。